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漏检杂质,分析方法建立的大忌!!(超实用技巧,赶快收藏)

发布时间:2021-08-26

分析方法在药学质量研究中扮演重要的角色,普析手段目前还是在分析领域占据重要的位置,一般尤以RP-HPLC-UV占比最大,一个好的分析方法能有效检出样品中存在的所有杂质,不遗漏某些杂质的检出,以免误导工艺人员正确的开发。 

分析方法的建立往往在原料药的质量研究中应用颇多,选择合适的分析方法建立思路,快速过渡,以QBD思想快速筛选,以获得最优的分析方法,对于质量研究尤为重要。以下是我在实际工作应用中对于方法建立等方面的一些心得。
 

分析方法建立的常规思路
 


 

仿制药分析方法建立,一般有大量参考文献,可以在文献基础上进行优化,事半功倍! 

创新药分析方法建立,一般参考文献较少,在理论与经验结合的基础上快速建立方法!在RP-HPLC-UV建立之初,我们通常需要完成以下准备:
 

1、原料药与杂质结构分析,获得重要信息
原料药与杂质pKa判断,以选取流动相体系最佳pH值。
 

 

流动相pH值一般选取pKa±2范围之外,以保障化合物处于分子状态,减少电离,此状态下化合物疏水性较强,色谱柱保留时间较长,能获得良好的峰型。

  • 酸性化合物,可以选择非缓冲的流动相进行pH调节,用单一的酸溶液(一般常用磷酸)进行色谱分离,酸的浓度应足以使pH值比需要值低的多。
  • 碱性化合物,选择是比较有限的,TEA/氨水可以用于调节到高的pH值,但是要求色谱柱能够耐碱比较好。

2、流动相缓冲盐选取

缓冲体系选择的要求:能适当控制离子化、与检测器兼容性、缓冲盐溶液与有机相的互溶性、流动相的pH是否在色谱柱的安全范围内。

常用的缓冲体系的盐一般为磷酸盐与醋酸盐体系,其pKa见下表:
 


3、洗脱剂的选取
反相体系下,常用的洗脱剂为甲醇、乙腈与四氢呋喃。三种溶剂对比如下:
 


3、洗脱剂的选取

a. 影响分离度的总因素

选择性:α;柱效:N;保留因子:N

选择性是影响分离度的最关键因素 :

  • 改变固定相 

  • 改变流动相

柱效是最容易预测和改变的因素;

最理想的保留范围:1<K<10

  b. 影响分离度的色谱条件


 

 

 
5 方法建立过程中其他的关注点

    a. API与杂质溶解性

直接影响:杂质提取不充分,检测结果不平行,重现性结果差!

间接影响:回收率波动较大,方法建立与方法验证结果不匹配。

主成分在稀释剂中的饱和溶解度,最好满足饱和溶解度大于3倍的供试品浓度。

  b. 灵敏度

检测灵敏度不满足,高浓度溶解性会有问题,浓度太大,峰拖尾影响检测,易损坏色谱柱,在遗传毒性杂质方法建立过程中尤为突出。

  c. 酮式烯醇式互变

同一化合物有两个响应接近的峰,主峰伴随着一个较大的未知峰,峰有台阶,互变影响峰型。 

具体可参考占小兵老师的“HPLC方法开发需注意的典型特殊结构化合物专题:酮式烯醇式互变”。

  d. 溶剂效应

优先采用流动相体系,降低溶剂强度(如增加水相比例,调整pH等)。 

助溶剂选择,最好控制在5%以内,避免强溶剂效应。

  e. 极性化合物弱保留

强保留型色谱柱(AQ色谱柱…..),离子交换色谱柱,离子对试剂, HILIC模式。 

离子对试剂 

  • 酸性化合物:四丁基氢氧化铵、四丁基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵等。
  • 碱性化合物:烷基磺酸盐类,如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠等。三氟乙酸、五氟丙酸等全氟取代的直连有机酸等。
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分析方法可靠性评估

防止漏检杂质,最重要的就是需要进行分析方法可靠性评估,以判断分析方法的适用性。 

分析方法的建立,是一个系统的工程,在有参考文献的条件下,需要评估方法的可靠性;线性洗脱程序的合理性,也是检验方法适用性重要的一环。

常规做法:

  • 根据合成工艺路线及降解途径分析可能产生杂质的全面性。

  • 采用强制降解试验来判断方法的适用性。

  • 延长梯度洗脱高比例洗脱剂洗脱时间,防止小极性杂质漏检。

药典方法不一定是最好的!

 

案例: FMN项目,采用药典条件无法将小极性杂质有效洗脱,导致可能会误导工艺开发,假阴性判断药品质量。

方法对比如下:
 
 
经验总结
 
1.在有参考标准前提下,要理性判断分析方法的可靠性,以免获得假阴性结果误导工艺开发,要时刻谨记:药典方法不一定是最好的!
2.分析方法的建立没有最优,只有最适合,排除化合物本身的性质,更重要的要适用于现有工艺路线,以能有效检出对应工艺杂质及降解杂质,防止漏检杂质即可。
 
-END-
 
关于我们:

       北京新领先杂质研究事业部,致力于原料药注册申报及杂质定向合成,通过杂质定向合成及杂质制备富集,获取杂质对照品,解决药物研究中杂质研究难点。通过制定有效的杂质研究和控制策略,降低质量研究工作量,缩短研发周期;创新分析方法,解决常规分析中分离与分析的难点,建立快速、稳定的分析方法。 

       杂质研究事业部由五个中心组成,分别为杂质对照品中心、质控中心、研发中心、工艺转化中心和技术服务中心。分别对应于杂质定制、质量研究、工艺开发、工艺转化和技术服务。部门内拥有Waters UPLC SQD2杂质纯化系统、GilsonGX-281型制备系统、Agela快速纯化系统、创新通恒LC6000制备系统、WatersSFCⅡ型馏分收集系统等。能快速富集杂质,根据MS信息,推测并获得杂质结构,解决未知杂质来源、传递及控制策略。 

       杂质研究事业部成员均具有多年原料药开发和杂质制备研究相关经验,尤其在抗生素领域获得很多研究成果。目前可提供满足申报要求的原料药研发和全套杂质定制服务,欢迎药界朋友垂询相关业务。


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